دانش علوم آزمایشگاهی

قارچ شناسی

 

روش های صحیح نمونه گیری در قارچ شناسی:

 

روش های تشخیص در قارچ شناسی به ترتیب زیر است :

نمونه برداری
آزمایش مستقیم
تهیه گسترش و رنگ‌آمیزی
کشت
تست‌های سرولوژی
 تست‌های بیولوژیک
تلقیح به حیوانات حساس آزمایشگاهی
 

نحوه نمونه برداری در ضایعات مختلف قارچی و بررسی انواع نمونه های قارچی

همان طور که در ادامه خواهید دید تنوع نمونه ها در قارچ شناسی زیاد است و نمونه ممکن است از هر قسمتی از بدن گرفته شود .


نمونه هاي سطحي

 مو، قطعات ناخن، پوست
پوشش وزیکولها و تاولها
پوسته‌های ریز و شوره
تراشهای جلدی

چرک ضایعات عمقی‌تر

ضایعات باز یا بسته و مسدود جلدی
آبسه‌های عمقی بدن مانند آبسه‌های چرکی شده آپاندیس

بیماریهای عمومی شونده


خون محیطی (در هیستوپلاسموزیس)
مایع نخاع (در کریپتوکوکوزیس)
پونکسیون مغز استخوان و یا غدد لنفاوی و یا بیوپسی اعضاء درونی بدن

بیماریهای قارچی ریه

خلط
شستشوی برنش و یا بیوپسی جدار آن بوسیله برونکوسکوپی

ساير نمونه ها


ترشح واژن (در کاندیدیازیس)
ادرار
مدفوع و ...
 


آماده سازي بيمار قبل از نمونه گيري

فرد نمونه گیر در آزمایشگاه قارچ شناسی باید قبل از نمونه گیری درخواست های زیر را بیمار داشته باشد در غیر این صورت تشخیص اشتباه و یا غیر ممکن خواهد بود . برای نمونه اگر فرد قبل از ازمایش از کرم استفاده کرده باشد باعث پوشانیده شدن ضایعه شده و در زیر میکروسکوپ چیزی دیده نخواهد شد. بنابراین اگر به چنین شرایطی برخوردید باید نمونه گیری را چندذ روز بعد دوباره انجام داد. 


عدم استحمام بيمار يا شستشوي محل ضايعه به مدت 7-4 روز
 عدم استفاده از كرم يا داروهاي موضعي در محل ضايعات سطحي
 گاهي ناشتايي
 پاك نمودن محل ضايعه از فلور نرمال
 


نكاتي راجع به تعیین محل نمونه‌برداری


چنانچه ضایعات متعددی در مراحل مختلف پیشرفت در بدن وجود داشته باشد بهتر است که نمونه برداری را از ضایعات تازه و فعال انتخاب کرد .
نمونه برداري از لبه برجسته و خارجی ضايعات بهتر است انجام گیرد .
در صورت تعدد ضایعات بهتر است که از فرد فرد آنها نمونه‌برداری نمود .
نمونه ‌برداری بخصوص از نواحی که درمانهای موضعی در آنها صورت نگرفته است باید مورد توجه باشد
در بیشتر موارد لازم است که از عمق و منبع اصلی کانون بیماری نمونه‌برداری نمود.
 


نمونه برداري از زخمهای شدیداً چرکی :

بايستي قبلا چند روزی بیمار را تحت درمان با داروهای ضد میکربی سبک قرار داده و پس از برطرف شدن عفونت چرکی زخم، از آن نمونه‌برداری نمود. باید این نکته را در نظر داشته باشیم که:در نمونه‌برداری قارچی بايستي مقادیر بیشتری از ناحیه زخم برداشت نمود و نمونه اولیه بدست آمده را جهت آزمایش مستقیم و نمونه ثانوی را که از محل عمقی‌تر تهیه می‌شود بعلت کمتر بودن آلودگی جهت کشت استفاده کرد.

 


روشهاي نمونه ‌برداری از ضایعات


بيماري هاي قارچي سطحي


قارچهای مولد این بیماری‌ها عبارتند از:

Malassezia furfur عامل بیماری تینه آورسیکالر (Tinea versicolor)
 Trichosporon cutaneum عامل بیماری پیدرای سفید (with piedra)
 piedra hortai عامل بیماری پیدرای سیاه (Black piedra)
 cladosporium werneckei عامل بیماری تینه آنیگرا (Tinea nigra)

در تینه‌آ ورسیکالر و تینه آنیگرا ابتدا محل ضایعه را با الکل 70درصد به خوبی پاک کرده و سپس بوسیله نوار چسب اسکاچ و یا تراش جلد با اسکالپل، پوسته‌ها را جمع آوري مي كنيم و همچنین در بيماري هاي سطحي مو مثل پيدراها مي توان موهاي ناحيه آلوده را قيچي كرده و برداشت نمود.
 
 
بيماري هاي قارچي جلدي


ضایعات مو


نمونه برداری باید در زیر چراغ وود و یا نور طبیعی صورت گیرد
اکثر ضایعات حاصله در اثر انواع میکروسپوروم‌ها در زیر چراغ وود- چراغ اولترا ويوله فلورسانس زرد-سبز رنگ می‌دهد
  ضایعات حاصله در اکثر سپس های ترایکوفایتون و نیز میکروسپورم جیپسئوم فاقد این خاصیت می‌باشند
  در ضايعات كچلي مو ابتدا ناحيه را با گاز آغشته به الكل تميز نموده و سپس بوسيله پنس سرپهن يا موچين حدود 10 تار مويي كه شكسته يا تغيير رنگ داده يا كدر شده يا غلاف دارد را كنده و جمع آوري مي كنيم
 
ضایعات پوستي
نمونه برداری باید در زیر چراغ وود و یا نور طبیعی صورت گیرد.
بيمار نبايستي از حدود يك هفته قبل از نمونه برداري حمام كرده يا از داروهاي خوراكي يا موضعي استفاده كرده باشد
انواع روشها در نمونه گیری از پوست


استفاده از نوار چسب اسكاچ
استفاده از اسكالپل كند استريل
استفاده از برس سر
 


ضایعات ناخن


قبل از نمونه برداري بايستي ناخن را با الكل تميز نموده و قسمت آزاد ناخن را بوسيله ناخن گير كاملاً جدا كرده و دور ريخت
قسمت سفت و صدفی ناخن و یا زوائد پنیری شکل نمونه‌های مناسبی جهت آزمایش قارچی نمی‌باشند
توسط اسكالپل استريل ، حدفاصل ناحيه سالم و آسيب ديده را تراشيده و تراشه هاي اوليه را دور ريخته و سپس مقداري از تراشه هاي گرفته شده از نزديك بستر ناخن را جمع آوري مي كنيم.
برای شفاف کردن ناخن می‌توان از پتاس 20٪ و کمی حرارت استفاده کرد
 


بیماری های قارچی زیرجلدی


بیماریهای این دسته شامل کروموبلاستوما یکوزیس (chromoblastomycosis)،مایستوما (mycetoma)،اسپوروتریکوزیس(Sporotrichosis) ورینوسپوریدیوزیس (Rhinosporidiosis) هستند.نمونه جمع‌آوری شده از این ضایعات ممکن است گرانول و چرک دملهای باز ، تراوشات اگزود ای ضایعات، مایع مجاری تخلیه‌ای یا دملهای سربسته ویا نسوج بدست آمده و بیوپسی باشند
 
بیماری های قارچی احشایی


نمونه جمع‌آوری شده از این ضایعات ممکن است چرک یا اگزودمای زخمها، مایع نخاع، خلط، خون محیطی، پونکسیون مغز استخوان و یا آبسه‌های مسدود، غدد لنفاوی و نسوج بدست آمده توسط یوپسی یا اتوپسی باشد
در اين دسته از بيماري ها آزمایش مستقیم ، کشت و در بعضی موارد تلقیح به حیوان حساس یا تست سرمی از نمونه بدست آمده باید انجام داد
 


نحوه بررسي نمونه ها در بیماری های قارچی احشایی

۱-چرک یا اگزودا

تهیه نمونه از آبسه:آسپيراسيون / باز كردن آبسه توسط اسكالپل
آماده سازی نمونه:بررسي مستقيم بدون تغيير در نمونه و يا پس از افزودن پتاس
رنگ امیزی:گرم و اسید فست

۲-نمونه برداري از خون

۳-مایع نخاع

آماده سازی نمونه:سانتريفيوژ كردن و استفاده از رسوب
رنگ آمیزی:مركب چين ، گرم و اسيد فاست
 


۴-نمونه برداري از دستگاه تنفس تحتاني


قطعات بدست آمده از نسج برنش توسط برونکوسکوپی
 

۵-خلط


نمونه صبحگاهي در حالت ناشتا
 شستشوي دهان با آب يا دهان شويه رقيق بدون قرقره كردن قبل از نمونه گيري
بررسي نمونه از نظر مناسب بودن
موارد ارزش دار جداسازي عوامل قارچي از نمونه خلط
نحوه بررسی مستقیم:بررسي با آب و پتاس
رنگ آمیزی:مركب چين ، گرم و اسيد فاست و رنگ آميزي هاي خوني
 


۶-خون و پونکسیون مغز استخوان و غدد لنفاوی

رنگ آمیزی:گیسما یا رایت
کشت:در مورد مغز استخوان و غدد لنفاوی مقدار کشت در هر لوله 0.2cc و در مورد خون یا پونکسیون مغز استخوان خون‌دار 2-3cc است
تلقيح به حیوان حساس آزمايشگاهي
 

۷-نمونه هاي بیوپسی و اتوپسی


ارسال نمونه در سرم فيزيولوژي استريل 
تقسيم نمونه به قطعات کوچک با رعایت کامل شرایط ضدعفونی  
تهيه گسترش به روش تماس بافت با سطح لام
کشت در محیط‌های اختصاصی به روش مالیدن و له کردن در روی سطح محیط
تلقيح به حیوان حساس آزمايشگاهي
 


۸-نمونه برداري از واژن


توسط دو سواپ از نواحی آلوده برداشت مي كنيم
درون محیط ترانسپورت و در 4 درجه سانتي گراد به آزمایشگاه ارسال می‌گردند
یکی از سواپ‌ها را برای تهیه اسمیر و دیگری را برای کشت بكار مي بريم
 

  ۹-نمونه برداري از سایر مایعات بدن مانند پلور، سینویال و صفاق

جمع آوري نمونه درون لوله‌های استریل محتوی هپارین 
در صورتیکه مایعات بدن چرکی باشند نباید نمونه‌ها سانتریفيوژ شوند 
مایعات شفاف را با دور 1200در دقیقه به مدت 10دقیقه سانتریفيوژ نموده ، رسوب را جهت آزمایش مستقیم و کشت استفاده می‌كنيم
 


۱۰-نمونه برداري از غشاهاي مخاطي


استفاده از اسكالپل كند استريل
استفاده از سواپ مرطوب
در ضایعات مشکوک به کاندیدا آلبیکنس(candida albicans) تهیه گسترده جهت رنگ‌آمیزی ضرورت دارد و نمونه جمع‌آوری شده را بلافاصله باید کشت داد .
 


۱۱-نمونه برداري از گوش


نمونه‌ها توسط سواپ استریل یا رینگ مخصوص تهیه و در لوله استریل یا محیط انتقالی (ترانسپورت) نگهداری می‌شوند
استفاده از اسكالپل جهت جمع آوري پوسته
 


۱۲-نمونه برداري از چشم


در کراتومایکوزیس، نمونه معمولاً تراشه‌های قرنیه می‌باشد
در صورت گرفتاری ملتحمه، نمونه‌ها توسط اسپا چولای پلاتینی و یا سواپ تهیه می‌شوند
نمونه‌ها باید مستقیماً روی محیط کشت برده شده و قسمتی هم جهت اسمیر استفاده شود
 


۱۳-نمونه برداري از مدفوع


نمونه در ظرف استریل جمع‌آوری می‌شود
سواپ‌های رکتال درون محیط ترانسپورت ارسال می‌شوند
نمونه‌ها باید به سرعت و در 4 درجه سانتي گراد به آزمایشگاه ارسال ‌گردند
نمونه‌ها نبایستی به مدت طولانی نگهداری شوند زیرا باعث رشد مخمرها می‌شود
 


ارسال نمونه جمع‌آوری شده بوسیله پست


مو، پوست، ناخن را درون پاکت کوچک نمونه ‌برداری قرار داده و بعد از بستن آنها در پاکت معمولی گذاشته و ارسال مي كنيم
 نمونه‌های دیگر مانند خلط، ادرار، و تراوشات دیگر بدن را بهتر است قبلاً در محیط کشت مناسبی کشت داده و لوله‌های کشت شده را به آزمایشگاه ارسال داشت، یا آنها را درون سرم فیزیولوژی استریل قرار داده و بعد از یخ‌زدن درون یخ خشک گذاشته و به خوبی بسته‌بندی نموده و ارسال مي كنيم
قارچ مربوط به شوره سر:

همانطور که میدانید بیماریهای ناشی از قارچها بر خلاف سایر میکروارگانیسمها خطرناک نیستند و اغلب به جای اینکه از انها با نام بیماری یاد شود بیشتر اختلال در زیبایی یاد میشود . چون بیشتر مشکلاتی که قارچها (به ویژه قارچهای سطحی Superficial Mycosis) ایجاد میکنند در سطح شاخی شده پوست قرار دارند و در بیشتر مواقع به علت تغییر رنگ و یا مشکلی خاصی که در روی پوست ایجاد میکنند فرد را وادار به واکنش میکند .
یکی از بهترین نمونه ها ، شوره سر است که شاید هر انسانی در طول عمر خود مدتی را با ان سرو کله شده باشد . عامل شوره سر مخمری لیپوفیل به نام مالاسزیا اوالیس(Malassezia ovalis) - پیتروسپروم اوال(Pityrosporum ovale ) - است که فلور 90-70 درصد اپیدرم پوست افراد میباشد .
نحوه عمل این مخمر به این صورت است که قارچ در سر سبوم را به اسیدهای چرب تبدیل میکند چون این مخمر برای ادامه حیات به اسیدهای چرب به ویژه اسید اولئیک نیاز دارد و این امر سبب افزایش میتوز سلولهای اپیدرمی میشود که ادامه این عمل شوره سر را به دنبال خواهد داشت . در بیشتر افراد واکنش ازدیاد حساسیت به علت فراورده های قارچی هم دور از ذهن نیست .
افزایش ترشحات غدد چربی ساز پوست سر مهمترین عامل زمینه ساز بیماری است . و در هر دو جنس زن و مرد یکسان دیده میشود و باعث خارش و ریزش موها میشود .

تشخیص
میکروسکوپی : به شکل سلولهای مخمری بیضی منفرد یا خوشه دار در میان سلولهای اپیدرم
ماکروسکوپی : به علت مخمر بودن فاقد میسیلیوم است . و در محیط کشت که حاوی اسید چرب اولئیک باشد رشد میکند .
 
برای تشخیص این قارچ از روشهای گوناگونی استفاده میکنند یکی از این روشها استفاده از لامپ وود است که کونیدی ها را به صورت فلورسانس زرد طلایی نشان میدهد . با مشاهده این رنگ زرد با بیستوری از ضایعه نمونه برداری می کنیم و در زیر میکروسکوپ بررسی میکنیم .
برای برسی میکروسکوپی میتوان از هیدروکسید پتاسیم 10 درصد ، کریستال ویوله ، لاکتو کاتن بلو و یا ید استفاده کرد . از انجا که با مشاهده میتوان این قارچ را تشخیص داد در آزمایشگاه نیازی به کشت نیست اما در شرایط استثنایی که افتراق قارچها (مانند بیماری برص ، ماسک حاملگی ، اریتراسما و ..)در نظر است باید کشت انجام گیرد .

درمان
ممکن است شایعات به صورت خود به خودی از بین بروند ولی عوامل کراتولیتیک موثر خواهد بود . داروی انتخابی در بیشتر اوقات تیوسولفات 25 درصد و اسید سالسیلیک 1 درصد در الکل ایزوپروپیل 10 درصد و پروپیلن گلیکول است . در بیشتر افراد قرص کتوکونازول به مدت سه هفته در پروسه درمان استفاده میشود
نمونه برذاری درآزمایشگاه قارچ شناسی:

مقدمه
آزمایشگاه قارچ شناسی یکی از بخش های آزمایشگاه می باشد که وظیفه آن جمع آوری نمونه های مشکوک و بررسی آنها می باشد. بررسی نمونه های قارچی بیشتر شامل تهیه لام ، رنگ آمیزی ، کشت و... می باشد . در بسیاری از مراکز بهداشتی و درمانی و همچنین در بیمارستان ها و آزمایشگاه ها از روش تشخیصی با استفاده از لام استفاده می کنند .

پذیرش

یکی از مهمترین مراحل در بررسی نمونه های قارچ شناسی ، پذیرش می باشد که در آن به شرح زیر عمل می کنیم: 

ابتدا باید مطمئن شویم که فرد بیمار حداقل از 72 ساعت قبل محل مشکوک به ضایعه قارچی را نشسته و از هیچ روغنی استفاده نکرده باشد چون در صورت استفاده از روغن و یا شستشو ممکن است هیچگونه عامل قارچی در بررسی های میکوسکوپی مشاهده نشود.
مشخصات فرد بیمار را در دفاتر قارچ شناسی وارد می کنیم. این مشخصات عبارتند از: نام ، نام خانوادگی، سن، جنس، شغل، محل زندگی و محل ضایعه قارچی .
  جمع آوری و تهیه نمونه

به منظور تشخیص عفونت های قارچی لازم است که از نمونه هایی استفاده گردد که بتوان عوامل ایجاد کننده بیماری را در اغلب موارد جدا نمود . جمع آوری و انتقال صحیح نمونه به آزمایشگاه از اهمیت فوق العاده ای در جداسازی عوامل بیماری برخوردار می باشند . در آزمایشگاه قارچ شناسی بر حسب نوع و محل ضایعه نحوه نمونه برداری متفاوت خواهد بود. در زیر نحوه نمونه برداری از بافت هایی که ضایعات قارچی بصورت شایع در آنها دیده می شوند توضیح داده شده است:

ضایعات قارچی مو : مو ها باید از ریشه و بوسیله پنس استریل برداشت شوند. بعضی از قارچ هایی که مو ها را آلوده می کنند با چراغ وود فلورسانس دارند بنابرین باید موهایی که دارای فلورسانس هستند برای نمونه برداری انتخاب شوند. در صورتی که هیچ یک از آنها فلورسانس نداشته باشند ، مو های شکسته به همراه پوسته ها برداشت می شوند.

ضایعات قارچی ناخن : ابتدا توسط گاز آغشته به الکل 70% سطح موضع را پاک کرده سپس پس از کوتاه کردن ناخن اضافه ، از حد فاصل بین قسمت سالم و آلوده با یک اسکالپل استریل ناخن را می تراشیم. همچنین از قسمت های زیرین ناخن نیز نمونه برداری می کنیم.

ضایعات قارچی پوست : ابتدا با گاز آغشته به الکل 70% سطح ضایعه را پاک کرده تا عاری از آلودگی های سطحی گردد سپس با اسکالپل استریل از قسمت های حاشیه ضایعه که معمولا در کچلی بدن به شکل حلقوی و قرمز رنگ است، پوسته ها را می تراشند . در صورتی که ضایعه به شکل حلقوی مشاهده نشود باید از پوسته های قسمت هایی که آلوده تر به نظر می رسند برداشت گردد. 

 در صورتی که مجبور به نگهداری نمونه باشیم باید آن را در حرارت 4 درجه  سانتیگراد حداکثر تا 24 ساعت نگهداری نمود اگرچه در چنین شرایطی نیز تعدادی از اورگانیسم ها حیات خود را از دست خواهند داد
بررسی نمونه های قارچی

بررسی نمونه های قارچی شامل : آزمایش مستقیم نمونه های قارچی (تهیه لام و بررسی زیر میکروسکوپ) ، رنگ آمیزی و کشت نمونه های قارچی می باشند.

آزمایش مستقیم نمونه های قارچی
آزمایش مستقیم نمونه های کلینیکی ، اولین و با ارزش ترین روش ها در بررسی بیماری های قارچی است زیرا :

در اغلب موارد می توان تشخیص قطعی و یا احتمالی بیماری را قبل از رشد عناصر قارچی داد.
در بعضی موارد مشاهده عناصر قارچی در نمونه ها بیش از جداسازی آنها از کشت اهمیت داشته و در نتیجه با گزارش سریع آن به پزشک و شروع درمان می توان موجب نجات جان بیمار گشت.
مشاهده عناصر قارچی راهنمای خوبی برای انتخاب محیط کشت مناسب و خاص بوده و جداسازی و تعیین هویت قارچ را سرعت می بخشد.
در آزمایش مستقیم نمونه ها از سرم فیزیولوژی ، پتاس ، مرکب چینی و کالکوفلور سفید  استفاده می شود.

یکی از مهمترین روشهای تشخیصی در بیماری های قارچی تهیه لام مستقسم با محلول هیدروکسید پتاسیم(KOH) است که علاوه بر نمونه های پوستی در مورد سایر نمونه ها مثل: خلط، چرک، ترشحات، بیوپسی، ادرار و مواد دفعی نیز به کار می رود. در شفاف کردن نمونه ها معمولا از رقت 10 درصد هیدروکسید پتاسیم استفاده می شود. اضافه کردن دی متیل سولفواکساید(DMSO) به محلول KOH باعث شفاف شدن سریع نمونه های ضخیم لایه شاخی و بافت ناخن خواهد گردید.

 جهت تشخیص قارچ مخمری کریپتوکوکوس نئوفورمنس اغلب از مرکب چینی استفاده می شود.
برای تهیه لام مستقیم قسمتی از نمونه اعم از مو، پوسته، ترشح، چرک، تراشه ناخن و غیره را روی لام قرار می دهیم. یک تا دو قطره KOH به آن اضافه می کنیم  سپس لاملی بر روی آن گذاشته و اندکی حرارت می دهیم به طوری که به جوش نیاید، زیرا رسوب کریستالهای پتاس مانع از تشخیص می شود.  30 – 20 دقیقه صبر می کنیم تا نمونه ها کاملا شفاف شوند سپس نمونه های شفاف شده را ابتدا با عدسی 10 و سپس با عدسی 40 میکروسکوپ بررسی می کنیم.در لام مستقیم عناصر قارچی را باید از ذرات چربی، بافت فیبری، الیاف پنبه، پشم، دانه های نشاسته و ... تشخیص داد.

 علت اینکه KOH به قارچ ها آسیب نمی رساند این است که دیواره قارچ ها سخت و خشن است و با ماده قلیایی آسیب نمی بیند ، در حالیکه بیشتر سلول های بافت ، پروتئین ها و .. در پتاس تجزیه می شوند.
 

لام های قارچ شناسی

         کریپتو کوکوس                     هیستوپلاسما                         فوزاریفورم

کریپتوکوکوسهیستوپلاسمافوزاریفورم

 

 

 

 

 

             ژئوتریکوم                     میکروسپروم کانیس              میسیلیوم کاذب کاندیدا

ژئوتریکوممیکروسپروم کانیسمیسیلیوم کاذب کاندیدا   

 

آبسیدیا                                      آبسیدیا                                  آلترناریا

آبسیدیا   ابسیدیا   الترناریا

 

آلترناریا ها

الترناریا   آلترناریا   آلترناریا

+ نوشته شده در  یکشنبه نوزدهم دی 1389ساعت 19:29  توسط مهیم نورائی  |