دانش علوم آزمایشگاهی

میکروب شناسی

رنگ آميزي اسپور به روش دورنر (Dorner)

سوسپانسيون غليظي از ارگانيسم‌ها، در آب مقطر و در لوله آزمايش تهيه مي‌كنيم سپس حجم برابري از كربول فوشين را به آن مي‌افزاييم. رنگ كربول فوشين را به روش زير تهيه مي‌كنيم:

فوشين قليائي  4 گرم

فنل  8 ميلي گرم

الكل  20 ميلي گرم

آب مقطر  100 ميلي ليتر

رنگ اميزي اسپور به روش دورنر

در ادامه لوله حاوي ارگانيسم را به مدت 10-5 دقيقه در حمام آب جوش قرار مي‌دهيم.يك لوپ از محتويات لوله آزمايش و يك لوپ از محلول 10 درصد فيلتره شده نيگروزين را روي يك اسلايد تميز با هم مخلوط مي‌كنيم.اسمير را بلافاصله با عبور سريع از روش شعله و با حرارت ملايم خشك مي‌كنيم و در آخر اسمير را در زير ميكروسكوپ مشاهده مي‌كنيم . اسپورها به رنگ قرمز و باكتري‌ها به صورت بي رنگ در يك زمينه خاكستري مشاهده خواهند شد.

  

رنگ آميزي كپسول به روش آنتوني

 

مقداري از ارگانيسم را از محيط كشت برداشت نموده و اسمير نازكي تهيه مي نمائيم. اسمير را خشك كرده ولي در مجاورت حرارت قرار نمي‌دهيم.سطح لام را با رنگ كريستال ويوله بمدت 2 دقيقه مي‌پوشانيم.با محلول سولفات مس 20% شستشو مي‌دهيم.و سپس لام را خشك مي‌كنيم.در آخر لام را با بزرگنمائي 1000× بررسی مي‌كنيم. كپسول به شكل هاله بي رنگ در اطراف باكتري مشاهده خواهد شد.

 

 تاژک یا فلاژله:

 

"اسيد تانيك و فوشين، فلاژله را مي‌پوشانند و ضخامت كافي در آن ايجاد مي‌كنند تا اينكه در زير ميكروسكوپ قابل مشاهده باشند. چون خود تاژک به علت نازک بودن به سختی و یا بیشتر اوقات اصلا در زیر میکروسکوپ نوری دیده می شود در ضمن همان طور که می دانید تاژک در باکتری ها برای حرکت استفاده می شود که از جنس پروتئین است 

روش رنگ آمیزی تاژک                                                                                                                                                                                                                      

اسلايد‌ها را در اسيد كلريدريك 3% در اتانول (95 درجه) براي مدت 4 روز غوطه ور مي‌كنيم تا اينكه به خوبي تميز شوند. سپس آنها را توسط آب بمدت 10 دقيقه شستشو مي‌دهيم. اين اسلايدها را به صورت عمودي قرار داده تا در مجاورت هوا خشك شوند.

اسلايد تميز را بر روي شعله آبي چراغ بنزن مي‌گيريم. يك فضاي كوچك مربع شكل را با استفاده از موم در سطح اسلايد تعبيه مي‌كنيم.

در درون فضاي موم، در يك انتهاي لام، يك قطره بزرگ آب مقطر را مي‌چكانيم.

مقدار كمي از كلني جوان باكتري را از سطح كشت برداشته و در آب مقطر سطح لام غوطه ور مي‌كنيم. و اجازه مي‌دهيم تا اين كه مقدار كمي از ارگانيسم‌ها به داخل آن وارد شوند. كمي لام را كج مي‌كنيم تا اينكه قطره آب به جهت مقابل اسلايد منتقل شود. سپس اجازه مي‌دهيم تا در مجاورت هوا خشك شود اما آن را در مجاورت شعله قرار نمي‌دهيم.

در حدود يك ميلي ليتر از محلول رنگ را در سطح لام مي‌ريزيم تا اينكه 15-5 دقيقه يك رسوب قرمز با جلاي فلزي آشكار شود.

اسلايد را به آرامي مي‌شوئيم و سپس آن را به صورت افقي باقي مي‌گذاريم تا اينكه در مجاورت هوا خشك شود 

تهیه لام میکروسکوپی

مشاهده مستقیم لام یکی از مهمترین و اصلی ترین مراحل تشخیص در آزمایشگاه باکتریولوژی است چون بر خلاف کشت باکتری ها که امکان آلوده شدن  نمونه ها وجود دارد با مشاهده لام مستقیم این مشکل تقریبا حل می شود . ما در حالت کلی در آزمایشگاه  در دو حالت لام تهیه میکردیم :

 الف ) تهیه لام از محیط کشت بعد از کشت باکتری و مشاهده کلنی ها

 معمولا بعد از ایزوله شدن باکتری ها در محیط کشت و رشد کلنی های خاص در محیط کشت ، برای ادامه مسیر تشخیص باید لام تهیه کرده و رنگ آمیزی گرم انجام بدهیم .

ب) تهیه لام از نمونه فرستاده شده به ازمایشگاه قبل از کشت

در برخی موارد خاص باید بعد از دریافت نمونه ها هر چه سریع تر از انها لام مستقیم تهیه کرد . در زیر لیست نمونه ها و شرایطی را که باید لام تهیه کرد را ذکر می کنیم:

نمونه CFS که دارای رنگ و یا رسوب خاص است . در این حالت بعد از سانتریفیوژ نمونه،از رسوب CFS لام مستقیم تهیه میکنیم .

نمونه خونی که دارای  کدورت و یا رنگ و یا نشانه خاص دیگری است که در این حالت هم از نمونه لام مستقیم تهیه می کنیم .

تهیه لام

 

برای تهیه لام از سرم فیزیولوژی استفاده می کنیم . علت اینکه از آب مقطر برای تهیه لام استفاده نمی کنیم  این است که آب مقطر فشار اسمزی را تغییر داده و باعث لیز باکتری ها می شود .  مقدار و محل برداشت کلونی(از یک کلنی مشخص برداشته شود) از محیط کشت برای تهیه لام بسیار پر اهمیت است و هرگونه اشتباه در این کار ما را شاید  دچار اشتباه کند . همیشه باید تناسب مقدار کلنی و مقدار سرم فیزیولوژی را حفظ کنیم . به عبارت دیگر لام ما باید همیشه هموژن باشد . اگر مقدار کلنی برداشته شده زیاد باشد در این صورت لام پس از رنگ امیزی گرم بسیار تیره و کدر بوده و بررسی عوامل باکتریایی را با مشکل روبه رو می سازد . اما اگر میزان کلنی کم باشد لام تهیه شده رقیق خواهد بود و در پیدا کردن عوامل باکتریایی در زیر میکروسکوپ دچار مشکل خواهیم شد .

در تهیه لام باید قبل از هر کاری شماره نمونه را بر روی لام درج کنیم .

قبل از تهیه لام باید به نوع محیط کشت  توجه کرد . برای نمونه ; در محیط کشت بلاد اگار هیچ وقت باکتری گرم مثبت و گرم منفی قابل تشخیص از یکدیگر نبوده و هر دو در این محیط رشد می کنند . اما در محیط SS همیشه کلونی ها ی گرم منفی رشد می کنند .

لام تهیه شده نباید وسیع باشد به عبارت دیگر اسمیر تهیه شده بهتر است در وسط لام و به میزان مناسب تهیه شود .

نکته بسیار مهمی که باید در تهیه لام به ان دقت کرد این است که همیشه باید از یک کلونی مشخص بر روی محیط کشت نمونه برداری کرد تا در بررسی میکروسکوپیک دچار سردرگمی نشویم .  

 

FIX کردن لام

پس از مخلوط کردن کلنی و سرم فیزیولوژی بر روی سطح لام و ایجاد یک اسمیر هموژن ، می بایست نمونه لام تهیه شده را به دلایل زیر فیکس کنیم :

باکتری ها کشته می شوند و در این صورت احتمال آلودگی تکنسین از بین می رود .

باکتری ها بر روی سطح لام تثبیت شده و به سطح لام می چسبند. .

طی عمل فیکساسیون  باکتری ها کشته شده و رنگ پذیر می شوند ( باکتری های زنده رنگ پذیر نیستند) .

 برای فیکس کردن لام ها در آزمایشگاه می توانیم از دو روش زیر استفاده می کردیم  :

حرارت (اکثرا). – در دمای 60- 45درجه سانتیگراد

الکل . ( متانول 100% )

رنگ آمیزی

الف) آماده سازي گسترش (Smear)نمونه هائي كه مي‌خواهند رنگ آميزي شوند را به صورت قطره (اگر مايع باشند) و غلطاندن (اگر بر روي سواب قرار دارند) بر روي يك اسلايد شيشه اي تميز و خشك قرار مي‌دهيم. اين مواد را مي‌توان در يك قطره آب مقطر استريل يا سرم فيزيولوژي استريلي كه بر روي اسلايد قرار دارد به صورت امولسيون درآورد.

نمونه های سواب معمولا به صورت سواب رکتال و یا سواب از آبسه و چرک تهیه می شود و از نمونه های مایع هم می توان به CFS و خون اشاره کرد

از يك نمونه بيشتر نيز مي‌توان بر روي يك اسلايد گسترش تهيه نموده و رنگ‌آميزي كرد. بدين منظور با استفاده از يك مداد شمعي و يا مداد الماسي مي‌توان اسلايد را به قسمتهاي مختلفي تقسيم كرد. از آنجا كه ممكن است برخي از ارگانيسم‌ها بعد از رنگ آميزي بر روي لام زنده باشند، بايد لام‌هاي رنگ آميزي شده را پس از استفاده در ظروف حاوي مواد گندزدا انداخت.(مانند ساولن)

 

ب) رنگ آميزي گرم

اين رنگ آميزي ابتدا بوسيله هانس كريستيان گرم در اواخر قرن نوزدهم كشف شد.

پس از ثابت كردن اسلايد (Fixation)، اولين مرحله رنگ آميزي گرم، اضافه نمودن كريستال ويوله است. پس از كريستال ويوله محلول يد گرم به عنوان دندانه (mordant) به رنگ قليائي كه با اتصالات شيميايي به ديواره سلولي باكتريها متصل شده، اضافه مي‌كنيم. اضافه كردن محلول رنگ بر (decolorizer) باعث تمايز سلول‌هاي گرم – مثبت و گرم – منفي مي‌گردد.

اضافه كردن رنگ مخالف (counter stain) مانند سافرانين يا كربول فوشين اين ارگانيسم‌هاي شفاف را رنگ نموده و آنها به رنگ صورتي يا قرمز در مي‌آيند. اگر چه رنگ مخالف بوسيله باكتريهاي گرم – مثبت نيز جذب مي‌شود، اما رنگ ارغواني آنها تغييري نمي‌كند. 

روش رنگ امیزی گرم  

خلط را مي‌توان جهت مناسب بودن آن براي كشت بوسيله تخمين يا تعيين سلول‌هاي اپي تليال سنگفرشي و لكوسيت‌هاي چند هسته اي موجود در نمونه ارزيابي نمود. اگر بيشتر از 10 سلول اپي تليال در هر ميدان با بزرگنمائي پايين (100×) وجود داشته باشد. خلط با فلوراي دهاني آلوده بوده و جهت كشت مناسب نمي‌باشد. وجود چند سلول اپي تليال يا عدم وجود آنها و بيشتر از 25 لكوسيت چند هسته اي نشان دهندة يك نمونه خوب مي‌باشد.

ادرار سانتريفوژ نشده را نيز مي‌توان جهت بررسي باكتريوري ارزشمند به روش گرم رنگ آميزي نمود. يك قطره در حدود چند ميكروليتر از ادرار خوب مخلوط شده و سانتريفوژ نشده را در سطح يك اسلايد قرار داده و اجازه مي‌دهيم تا خشك شود. وجود يك باكتري يا بيشتر در اكثر ميدانهاي روغني (1000×) نشانگر بيشتر از 100000 ميكروارگانيسم در هر ميلي ليتر ادرار مي‌باشد. گلبولهاي سفيد نيز با اين روش بايد مورد توجه قرار گيرند.

 

سایر رنگ امیزی ها باکتریولوژی

 رنگ آميزي اسيد – فاست (Acid – Fast staining): برای شناسایی TB (عامل بیماری سل)

رنگ آميزي متيلن بلو: نمونه مشكوك به ديفتري مورفولوژي باكتريهاي فوزيفرم و اسپيروكت را رنگ امیزی می کند .

 

ج)رنگ آميزيهاي افتراقي جهت انگلها 

اين رنگ آميزيها شامل رنگ آميزي تري كروم و هماتوكسيلين آهن مي‌باشد. رنگ تولوئيدين (Toluidine O) جهت حضور پنوموسيستيس كاريني به رنگ آميزي نقره جهت مشاهده ساختمان انگلها به كار مي‌رود.

 

د) رنگ آميزيهاي افتراقي جهت گسترش‌هاي خوني و مقاطع بافتي

انگلهائي كه در جريان خون گردش مي‌كنند را مي‌توان در داخل گلبولهاي قرمز يا پلاسما ملاحظه نمود. رنگ آميزي رايت و گيمسا به طور معمول بيشتر مورد استفاده قرار مي‌گيرند. يك قطره بزرگ خون (به اندازه يك دو ريالي) را بروي يك قسمت از اسلايدها قرار داده و با كناره يك لام ديگر آنرا حركت دوراني مي‌دهيم تا دفيبرينه شود. براي مشاهده انگلها در چنين گسترش ضخيمي گلبولهاي قرمز بايد توسط آب ليز شوند.

رنگ آميزي گيسما در موارد زير نيز كاربرد دارد:

 مشاهده سلولهاي ويروسي يا ساير سلولهاي عفوني در نمونه‌هاي باليني مانند پايه وزيكولهاي مشكوك به هرپس.

تراش قرنيه جهت موارد مشكوك به كونژونكتيويت كلاميديا تراكوماتيس.

رنگ آميزي از كشت سلولي تك لايه عفوني مانند سلولهاي مك كوي از كشت كلاميديا.

رنگ آميزي بافت تهيه شده از مغز جهت بررسي توكسوپلاسموز.

رنگ آميزي نمونه‌هاي گرفته شده از زخم جهت بررسي ليشمانيا.

ساير رنگهائي كه جهت مقاصد ويژه استفاده مي‌شوند عبارتند از: رنگ آميزي يد جهت مشاهده انكلوزيونهاي كلاميديا در سلولهاي تك لايه آلوده، رنگ آميزي سلر (Seler's) جهت مشاهده اجسام نگري در بافت‌هاي آلوده به ويروس هاري و رنگ آميزي گيمنز (Gimenez) جهت كلاميديا ولژيونلا.

 

و) رنگ آميزي قارچها

عناصر قارچي را در نمونه‌هاي ثابت شده مي‌توان به چندين روش رنگ آميزي نمود. PAS (پريوديك اسيد شيف) يكي از بهترين رنگهاي عمومي است كه عناصر قارچي را در نمونه‌هاي باليني (خلط و بافت) رنگ آميزي مي‌نمايد. رنگ آميزي متن آمين سيلور (Methen amin silver) هم روش دیگری است .

تشخیص آزمایشگاهی عفونت دستگاه  گوارش

ویبریوکلرا

ويبريوكلرا (Vibrio cholera) 

 

"خانواده ويبريوناسه شامل باسيل‌هاي گرم منفي، خميده، متحرك و داراي يك تاژك قطبي هستند و بخاطر اكسيداز مثبت بودن، از خانواده انتروباكترياسه متمايز مي‌گردند. اين ارگانيزم‌ها در آب دريا و سطحي يافت مي‌شوند. مهمترين گونه اين خانواده ويبريوكلرا است كه عامل بيماري اسهال وبائي پاندميك و اپيدميك محسوب مي‌گردد. علامت اصلي بيماري وبا، اسهال و كم آبي شديد، توقف جريان خون كاهش ادرار بوده و مشخصه اصلي اسهال وبائي، مدفوع آب برنجي است ."

براي تشخيص بيماران مشكوك به وبا استفاده از مدفوع تازه بهتر از سواب ركتال مي باشد، اما در طي فاز حاد بيماري مي‌توان از سواب نيز استفاده كرد. اين باكتري حساس بوده و بايستي نمونه مدفوع در محيط انتقالي كري بلير (Cary Blair) جمع‌آوري و به آزمايشگاه منتقل شود. بافر سالين – گليسرول مناسب نيست زيرا گليسرول اثر سمي روي عامل وبا دارد.

براي جداسازي ويبريو از محيط‌هاي مغذي مانند آبگوشت پپتون قليايي (pH=8.4) استفاده مي‌شود. پس از تلقيح مدفوع بمدت 5 تا 8 ساعت در حرارت 35 انكوبه شده و سپس  در محيط هاي كشت انتخابي و غيرانتخابي كشت مجدد مي‌شود. ويبريوكلرا در آگار خون گوسفند، شكلات، مك كانكي و نيز در آبگوشت كشت خون، تيوگليكولات و عصاره قلبي – مغزي رشد مي‌نمايد. اين باكتري در EME و SS آگار بخوبي رشد نمي‌كند. براي بدست آوردن ويبريو از نمونه مدفوعي بهتر است از محيط‌هاي انتخابي مانند TCBS (تيوسولفات سيترات بايل سالت سوكروز) آگار استفاده نمود. رنگ كلني ويبريوكلرا، در اين محيط زرد رنگ است.

(Telluride Taurocholate Gelatin) یا TTG آگار محيط انتخابي ديگري است، اما متأسفانه به شكل تجاري در دسترس نيست . آگار قليايي عصاره گوشت (MEA) و آگار نمك صفراوي، محيط كشت ارزان قيمتي نسبت به محيط TCBS آگار است كه نتايج خوبي نيز دارد. كلني‌هاي ويبريو، كروي ، محدب با سطح صاف و در تابش نور مايل كدر بوده و دانه‌دار هستند. در مك كانكي آگار كلني‌هاي بي‌رنگ توليد مي‌كنند. نمونه مناسب براي كشت، رشته‌هاي مخاطي مدفوع است. در اكثر آزمايشگاهها ركتال سواب مستقيماً بر سطح محيط‌هاي كشت آگاردار تلقيح مي‌شود. مقدار تلقيح نمونه در اين محيطها حائز اهميت است. معمولاً در محيط‌هاي كشت انتخابي سه لوپ و در محيط‌هاي ديگر يك لوپ از مدفوع كافي است. در اسميرهاي تهيه شده از مدفوع، ويبريوكلرا، نماي خاصي ندارد. ميكروسكوپ زمينه تاريك و فاز كنتر است ممكن است ويبريوهاي بسيار متحرك را آشكار سازد.

خصوصيات رشد اين باكتري عبارت است: عدم توليد گاز از گلوكز، تخمير سوكروز، عدم تخمير لاكتوز و آرابينوز، تست ليزين دكربوكيسلاز مثبت، تست اورني‌تين دكربوكسيلاز مثبت و تست دي‌هيدرولاز آرژنين منفي است. تست اكسيداز يك آزمون اساسي براي شناسائي اوليه و سريعتر ويبريوكلرا است، آزمون اكسيداز بايد در آگار خوندار يا محيطي ديگر عاري از قندهاي قابل تخمير انجام گردد و محيط مك‌كانكي آگار (بدليل لاكتوز) و TCBS (بدليل سوكروز) مناسب نبوده و بطور كاذب منفي خواهد شد . چند تست تجاري براي تعيين هويت و تأييد ويبريوها وجود دارد مانند (API 20 E. Biomerieux) ولي اين تست‌ها قابل اعتماد نبوده و بهتر است از واكنش‌هاي بيوشيميايي و آگلوتيناسيون ارگانيزم توسط آنتي‌سرم‌هاي پلي والان استفاده كرد. ويبريوكلرا حاوي ليپوپلي‌ساكاريد است كه خاصيت آنتي ژني داشته و 139 گروه آنتي ژني دارد. گروه 01 و 0139 عامل وبا مي‌باشند. گاهي ويبريوكلرا غير از گروه 01 و 0139 باعث بيماري شبه وبايي مي‌گردد. ويبريوكلرا اپيدميك دو بيوتيپ دارد به نامهاي كلاسيك (Classical) و التور (El Tor). بيوتيپ التور برخلاف كلاسيك، هموليزين توليد مي‌كند و تست وژه پروسكوئر مثبت و در برابر پلي‌ميكسين B (50 ميكروگرمي) مقاوم است و نسبت به نوع كلاسيك، بيماري خفيف‌تري ايجاد مي‌كند.

سوشهاي توليد كننده سم وبا در سر و گروه 01 را مي توان به ساب تايپ هاي اوگاوا (Ogawa)؛ اينابا (Inaba) و هيكوجيما (Hikojima) تقسيم‌بندي كرد. تمامي ويبريوكلراهاي جدا شده را بايد براي تعيين بيوتايپ و سروتايپ به آزمايشگاه رفرانس ارسال كرد .

ويبريوكلرا را مي توان بر اساس حساسيت به ماده 2 و 4- دي آمينو -6 و 7 دي ايزوپروپيل پتريدين (129/O)، از باسيل هاي گرم منفي اكسيداز مثبت مانند آئروموناسها و پلزيوموناس شيگلوئيدز متمايز كرد. ويبريوكلرا، قادر به رشد در pH بسيار بالا (5/8 تا 5/9) بوده و به سرعت در برابر اسيد كشته مي شود. ويبريوكلرا براي رشدش نيازي به نمك ندارد و قادر به رشد در حضور 6 درصد كلرور سديم نيست، بنابراين رشد در نمك 6 درصد يك مرحله كليدي براي افتراق ويبريو كلرا از ويبريوهاي هالوفيل مانند ويبريو پارا-هموليتيكوس است. از تست String مي توان براي افتراق ويبريو از آئروموناس و پلزيوموناس استفاده نمود. در اين آزمون ارگانيزم در داكسي كولات سديم 5/0 درصد امولسيفيه شده و سلول‌هاي ويبريو ليز و DNA آنها آزاد مي شود. بدين ترتيب حالت چسبناكي و ريش ريش شدن به كمك لوپ قابل مشاهده خواهد بود. توكسين وبا توسط روش ELISA و واكنش آگلوتينه شدن توكسين با آنتي توكسين قابل شناسايي است اما استفاده از اين روش معمول نبوده و اغلب در تحقيقات اپيدميولوژيكي از آن سود مي‌جويند.

در كشورهاي اندميك يك كارشناس با تجربه مي تواند به راحتي با حداقل روشهاي آزمايشگاهي از قبيل حركت در زمينه تاريك و يا آزمون استرينگ ارگانيزم را شناسايي كند اما در كشورهايي كه ابتلا به بيماري نادر است با انجام يكسري از آزمايشهاي بيوشيميايي و سرولوژيكي قابل تشخيص هستند.

ويبريو پاراهموليتيكوس از طريق غذاهاي دريايي آلوده انتقال مي‌يابد و از علل عمده اسهال در ژاپن محسوب مي گردد كه بيشتر در اثر خوردن ماهي خام است. اسهال ايجاد شده خودبخود محدود شونده مي باشد. اين باكتري اصولاً بر اساس توانايي رشد در حضور نمك طعام 6 درصد و رنگ سبز كلني در محيط TCBS آگار از ويبريوكلرا متمايز مي گردد.

كمپيلوباكتر (Campylobacter)

 

 

"اسهال ناشي از كمپيلوباكتر حداقل به اندازه سالمونلا و شيگلا شيوع دارد. اسهال كمپيلوباكتري بيشتر شبيه اسهال هاي باكتريايي (خصوصاً شيگلا) مي باشد. منبع عفونت شير، غذا، تماس با حيوانات و انسان و ترشحات آنها مي باشد. در دو سوم از موارد سبب اسهال آبكي و در يك سوم موارد باعث اسهال خوني مي شود. تب گاهي ديده مي شود و شدت اسهال كم و 2 تا 5 روز طول مي كشد. كمپيلوباكترژوژوني يك باسيل گرم منفي، سخت رشد و متحركي است كه در حرارت 25 درجه سانتيگراد رشد نمي كند. بهترين درجه حرارت رشد آن 42 درجه سانتيگراد مي باشد. براي جداسازي آن بهتر است نمونه اسهال در دو پليت در دو دماي 37 و 42 درجه سانتيگراد انكوبه شود. براي كشت كمپيلوباكتر، محيط انتخابي مانند اسكايرو (Skirrow) ، باتزلر (butzler)  و كمپي باپ (Campy-BAP) لازم است. در شرايط ميكروآئروفيليك رشد آن تشديد مي شود. يك روش آسان براي جدا كردن اين باكتري از مدفوع قرار دادن پليت ها در يك جار بيهوازي و توليد گاز با كمك گاز پك مخصوص مي باشد. كلني هاي آن پس از 48 تا 72 ساعت بيرنگ يا خاكستري و كمي موكوئيدي است. اين باكتري اكسيداز و كاتالاز مثبت بوده و هيپورات را هيدروليز مي نمايد. مقاوم به سفالوتين و حساس به ناليديكسيك است، كربوهيدراتها را تخمير نكرده و H2S ايجاد نمي كند. در اسمير رنگ آميزي شده با فوشين آبكي 1 درصد و يا گرم از مدفوع، كمپيلوباكترها به اشكال ويرگول، S شكل و يا شبيه بال پرنده در حال پرواز مشاهده مي شوند. در صورت مثبت بودن اسمير اسهالي، 45 درصد و در صورت منفي بودن 99 درصد ارزش تشخيص دارد. اين باكتري در زير ميكروسكوپ زمينة تاريك يا فاز كنتراست، تحرك دارتي شكل از خود نشان مي دهد."

 

اشريشيا كلي (E.Coli)

اشريشيا كلي (E.Coli)

 

"اشريشيا كلي، باسيل گرم منفي و شاخصترين عضو خانواده انتروباكترياسه است كه معمولاً گلوكز، لاكتوز، تره هالوز، و زايلوز را تخمير مي كند. اندول و متيل رد مثبت بوده و از توليد H2S، DNase، اوره‌آز و فنيل آلانين دآميناز عاجز است قادر به رشد در حضور سيانيد پتاسيم و يا استفاده از سيترات به عنوان تنها منبع كربن نيست. اغلب متحرك است و وژه پرسكوئر منفي مي باشد. اين باكتري معمولا بر روي بلاد آگار، هموليز بتا و بر روي مك كانكي آگار كلني هاي صورتي تيره با هاله كدر صورتي رنگ در اطراف كلني ها بخاطر رسوب املاح صفراوي ايجاد مي كند . اشريشيا كلي هاي مولد اسهال از لحاظ خصوصيات بيوشيميايي مشابه انواع فلور طبيعي غيرپاتوژن هستند ولي بعلت داشتن فاكتورهاي ويرولانس از آنها متمايز مي شوند. حداقل 6 تيپ از اشريشيا كلي هاي مولد اسهال شناسايي شده اند:"

1-‌EPEC : اشريشيا كلي انتروپاتوژنيك

2-‌ EHEC: اشريشيا كلي انتروهموراژيك (يا VTEC: اشريشيا كلي مولد وروتوكسين).

 

شيگلا (Shigella)

شيگلا (Shigella)

 

"شيگلاها از اعضاي خانوادة انتروباكترياسه بوده و از نظر تاكسونومي به اشريشياكلي (بويژه EIEC) بسيار نزديك هستند. گونه هاي شيگلا بويژه شيگلا ديسانتريه (S.dysenteriae) مي توانند سندرم اسهالي ايجاد نمايند كه با حضور مقادير فراواني خون و چرك در نمونة مدفوع مشخص مي گردد. شيگلوز  (Shigellosis) مسري ترين فرم در بين اسهالهاي باكتريايي است ولي تهاجم عميق‌تر به ناحيه  گره هاي لنفاوي يا جريان خون، شايع نيست. گونه هاي ديگر شيگلا عبارتند از: شيگلا سونه اي (S.sonnei)، شيگلا بويدئي (S.boydii)، و شيگلا فلكسنري (S.flexneri) كه ميزان شيوع آنها در كشورهاي مختلف، متفاوت است."

تشخيص آزمايشگاهي:شيگلا ها، ارگانيسم هاي حساس هستند كه در خارج از بدن ميزبان بمدت طولاني زنده نمي مانند. اين ارگانيسم ها بويژه به pH اسيدي حساس‌اند و به همين خاطر نمونه هاي مدفوعي تهيه شده از بيماران را بلافاصله بايد مورد بررسي و كشت قرار داد. نمونه هاي اسهالي مبتلايان به شيگلوز حاوي چرك و خون هستند كه نشاندهنده وجود يك عامل تهاجمي در روده است. مدفوع خوني را هر چه سريعتر، بايستي در محيط كشت مناسبي نظير آنچه كه در سالمونلا مورد استفاده است، كشت داد. اين باكتري‌ها سولفيد هيدروژن توليد نمي كنند و لذا كلني هاي بدون خال سياه در سطح محيط هاي كشت انتخابي ايجاد خواهند كرد. كلني هاي شيگلا در محيط HE آگار، به رنگ سبز، يا سبز آبي و در محيط XLD آگار بي‌رنگ يا قرمز رنگ خواهند بود.

شيگلاها باسيل هاي گرم منفي بي حركت و بدون كپسول هستند كه لاكتوز را تخمير نمي كنند (بجز شيگلا سونه اي كه اين قند را به تأني تخمير مي كند). تمامي گونه ها از تخمير قند گلوكز گاز توليد نمي كنند. ليزين دكربوكسيلاز، استات، موكات و زايلوز منفي‌اند كه بدين وسيله از اشريشياكلي ها متمايز مي گردند.

شيگلا ديسانتريه داراي 16 نوع (تايپ) آنتي ژني است كه نوع «يك» مولد توكسين شيگلاست. گونه فلكسنري به 6 نوع و 14 زير نوع (ساب تايپ) تقسيم مي شود و گونة بويدئي واجد 8 نوع سرولوژيكي و گونة سونه‌اي تنها داراي يك سروتايپ است كه با روشهاي سرولوژيكي مي توان آنها را از همديگر متمايز نمود. با تست هاي بيوشيميايي نيز مي توان برخي از گروههاي سرمي شيگلا را از بقيه تميز داد. مثلاً تنها شيگلا ديسانتريه (گروه سرمي A) است كه از تخمير قند مانيتول عاجز است. و تنها شيگلا سونه اي (گروه سرمي D) ، اورنيتين دكربوكسيلاز مثبت مي باشد .

 

يرسينيا انتروكوليتيكا (Yersinia enterocolitica)

"اين باكتري كه يك باسيل گرم منفي كوتاه و دوقطبي جزو خانواده انتروباكتريا است، سندرم شبيه سالمونلوز ايجاد مي كند. ارگانيسم ممكن است در شير و محصولات لبني غير پاستوريزه يافت شود و عامل رايج اسهال در مناطق سردسير است. بيماران مبتلا معمولاً داراي تب بوده و مدفوع آنها واجد گلبولهاي قرمز و سفيد خوني است. تهاجم باكتريها به گروههاي لنفاوي ممكن است منجر به ايجاد سندرم آدنيت مزانتر شود كه اين سندرم گاهي با آپانديسيت اشتباه گرفته مي شود. توانايي زنده ماندن اين ارگانيسم در دماهاي پايين يخچال، يك عامل مساعد كننده عفونت نيز محسوب مي شود كه البته از اين خصوصيت در تشخيص آزمايشگاهي باكتري نيز استفاده مي شود. از اين باكتري شش بيوتايپ و بيش از 60 سروتايپ شناسايي كرده اند كه سروتايپ هاي 0:3، 0:5,27 ، o:8 و o:9 بيش از بقيه از عفونتهاي انساني جدا مي شوند. "

تشخيص آزمايشگاهي:گونه هاي يرسينيا بخوبي در دماي 25 درجه سانتيگراد در محيط هاي كشت رايج نظير بلادآگار و مك كانكي آگار رشد مي كنند كه از اين خاصيت براي جداسازي و تشخيص آن در آزمايشگاه استفاده مي كنند، بعلاوه اين باكتري توانايي رشد و تكثير در دماي 1- تا 45 درجه سانتيگراد را دارد. با استفاده از محيط هاي كشت انتخابي نظير سفسوكودين – ايرگازان – نووبيوسين (CIN) آگار و كشت نمونه در آنها و انكوباسيون در دماي مذكور، امكان جداسازي اين باكتريها را آسان مي سازد. روش تغليظ در سرما (Cold enrichment) مانند قرار دادن. نمونه هاي مدفوع در محلول ايزوتونيك نمك (نرمال سالين) و نگهداري آنها بمدت 1 تا 3 هفته در 4 درجه سانتيگراد قبل از تلقيح نمونه به كشت انتخابي، امكان بدست آوردن ارگانيسم را بسيار افزايش مي دهد. يرسينياها از نظر توليد H2S (در TSI آگار) و تست هاي وژه پروسكوئر، سيمون سيترات، سيانيد پتاسيم، فنيل آلانين د آميناز و ليزين دكربوكسيلاز منفي اند ولي اوره آز، اندول ، متيل رد، و مانيتول مثبت اند. از طرفي يرسينيا انتروكولي تيكا، اورنيتين دكربوكسيلاز، سوكروز و سلوبيوز مثبت مي باشد كه بدين ترتيب از گونه هاي ديگر يرسينياها متمايز مي گردد. از روشهاي سرولوژيك نيز براي تشخيص اين باكتري مي توان استفاده نمود .

 

كلستريديوم ديفيسيل (Clostridium difficile)

"اين باكتري نوعي آنتروكوليت همراه با ايجاد غشاء كاذب در اثر تجويز آنتي بيوتيك هايي مانند كليندامايسين و لينكومايسين ايجاد مي كند. تشخيص بيماري بر مشاهده علائم اختصاصي در اندوسكوپ و مصرف قبلي آنتي‌بيوتيك همراه با نتايج آزمايشگاهي استوار مي باشد .. كلستريديوم ديفيسيل، باسيل گرم مثبت بي‌هوازي اجباري اسپوردار مي باشد كه در كشتهاي اوليه متحرك است. جهت ايزولاسيون كلستريديوم ديفيسيل از مدفوع  از محيط اختصاصي CCFA (Cycloserine Cefoxitine Fructose Agar) استفاده مي شود. بدين منظور محيط كشت در شرايط بي هوازي انكوبه مي شود. كلني هاي ميكروارگانيسم بر سطح آن به رنگ زرد با جلاي قوس و قزحي مي باشد. در محيط آگار خوندار بي هوازي، كلني هاي كلستريديوم ديفيسيل، خاكستري رنگ و مات بوده و در 24 تا 48 ساعت غيرهموليتيك هستند ولي تعداد معدودي از سويه ها ممكن است توليد آلفا هموليز نمايند. بعد از 48 تا 72 ساعت انكوباسيون، كلني هاي خاكستري با مركز سفيد بوجود مي‌آيند. از طرفي رشد باكتري در محيط هاي كشت بعلت توليد بوي شديد كود اسب كه جهت شناسايي كلستريديوم ديفيسيل اختصاصي است، بايد مورد توجه قرار بگيرد. اگر باكتري در زير نور لامپ وود (نور ماوراء بنفش) داراي فلورسانس زرد – سبز بوده و آزمايش لسيتيناز  (Lecithinase) و ليپاز منفي باشد مي توان آنرا بعنوان تعيين گونه اوليه گزارش نمود. شناسايي كلستريديوم ديفيسيل ايجاد كننده انتروكوليت با غشاء كاذب با اثبات توليد توكسين قطعي مي شود. براي اين منظور از تكنيك هايي مانند الايزا (ELISA) جهت شناسايي توكسين هاي A و B مي توان استفاده نمود. در اغلب آزمايشگاهها از روش آگلوتيناسيون لاتكس استفاده مي شود . " 

+ نوشته شده در  یکشنبه نوزدهم دی 1389ساعت 0:27  توسط مهیم نورائی  |